Rekonstitution bedeutet, ein gefriergetrocknetes Peptid wieder in Lösung zu bringen. Ziel ist eine Stammlösung mit genau bekannter Konzentration, aus der sich Aliquots für Versuche entnehmen lassen. Die Anleitung unten folgt gängiger Laborpraxis und den Hinweisen im Rekonstitutionsleitfaden von Peptides EU. Sie ersetzt nicht die Standardarbeitsanweisung (SOP) Ihres Labors.
Das passende Lösungsmittel
| Lösungsmittel | Eigenschaft | Typischer Einsatz |
|---|---|---|
| Bakteriostatisches Wasser | steriles Wasser mit 0,9 % Benzylalkohol, hemmt Keimwachstum | Stammlösungen, die über Tage mehrfach angestochen werden |
| Steriles Wasser | ohne Konservierungsmittel | Einmalgebrauch, Zellkultur, wenn Benzylalkohol stören würde |
| Verdünnte Essigsäure (z. B. 0,1 %) | leicht sauer | basische oder schlecht lösliche Sequenzen nach SOP |
| Puffer (PBS u. a.) | physiologischer pH | Verdünnungen direkt für den Versuch, weniger für Stammlösungen |
Schritt für Schritt
Vial akklimatisieren
Das Vial aus dem Gefrierschrank nehmen und verschlossen auf Raumtemperatur kommen lassen. So kondensiert keine Luftfeuchtigkeit auf dem Pulver.
Volumen festlegen
Die Konzentration ergibt sich aus Vialinhalt geteilt durch Lösungsmittelvolumen: 10 mg in 2 ml ergeben 5 mg/ml. Wählen Sie das Volumen so, dass Ihre geplanten Aliquots in einem gut pipettierbaren Bereich von etwa 50 bis 500 µl liegen.
Desinfizieren
Gummistopfen von Vial und Lösungsmittelflasche mit 70-prozentigem Alkohol abwischen und trocknen lassen. Sterile Spritze oder Pipettenspitze verwenden.
Langsam zugeben
Das Lösungsmittel an der Innenwand des Vials herunterlaufen lassen, nicht direkt auf den Pulverkuchen spritzen. Ein harter Strahl erzeugt Schaum und mechanischen Stress.
Schwenken statt schütteln
Sanft schwenken oder zwischen den Handflächen rollen, bis die Lösung klar ist. Kräftiges Schütteln kann Peptide aggregieren lassen. Manche Sequenzen brauchen einige Minuten.
Prüfen
Die Lösung sollte klar und partikelfrei sein. GHK-Cu ist durch das Kupfer typischerweise blau. Trübungen oder Flocken notieren und die Lösung nicht verwenden.
Beschriften und aliquotieren
Name, Konzentration, Charge und Datum auf das Vial schreiben. Für längere Aufbewahrung in Mikroreaktionsgefäße aufteilen und einfrieren.
Verdünnungsrechner
Tragen Sie den Vialinhalt, das Lösungsmittelvolumen und die gewünschte Menge pro Aliquot ein. Der Rechner gibt die Konzentration, das benötigte Volumen und die Anzahl möglicher Aliquots aus. Die Teilstriche beziehen sich auf eine U-100-Skala, bei der 100 Teilstriche einem Milliliter entsprechen.
Drei Rechenbeispiele
| Vial | Lösungsmittel | Konzentration | Volumen für 500 µg |
|---|---|---|---|
| 5 mg | 1 ml | 5 mg/ml | 100 µl |
| 10 mg | 2 ml | 5 mg/ml | 100 µl |
| 30 mg | 3 ml | 10 mg/ml | 50 µl |
| 50 mg (GHK-Cu) | 5 ml | 10 mg/ml | 50 µl |
Für sehr niedrige Konzentrationen, wie sie in Zellversuchen mit GHK-Cu üblich sind, ist eine serielle Verdünnung genauer als ein einziger großer Verdünnungsschritt. Beispiel: Die Stammlösung mit 10 mg/ml (rund 29 mmol/l, bezogen auf GHK mit 340 g/mol) in mehreren Zehnerschritten verdünnen, bis der Nanomolbereich erreicht ist.
Typische Fehler und wie man sie vermeidet
| Fehler | Folge | Abhilfe |
|---|---|---|
| Vial kalt geöffnet | Kondenswasser im Pulver, schnellerer Abbau | verschlossen auf Raumtemperatur bringen |
| Strahl direkt auf den Kuchen | Schaum, Proteinverluste an der Grenzfläche | an der Glaswand entlang zugeben |
| mg und µg verwechselt | Konzentration um Faktor 1000 falsch | Einheiten im Protokoll ausschreiben, Rechner nutzen |
| Volumen zu klein gewählt | Aliquots unter 10 µl, ungenaues Pipettieren | Volumen so wählen, dass Aliquots 50–500 µl betragen |
| Stammlösung mehrfach aufgetaut | Aggregation, Gehaltsverlust | sofort nach dem Lösen aliquotieren |
| Beschriftung vergessen | Charge und Datum nicht mehr nachvollziehbar | Etikett vor dem Lösen vorbereiten |
Ein guter Test für das eigene Vorgehen ist das Laborjournal: Lässt sich aus den Notizen für jedes Aliquot rekonstruieren, aus welchem Vial, welcher Charge und welcher Stammlösung es stammt, wann es hergestellt wurde und welche Konzentration es hat? Wenn ja, sind die Ergebnisse späterer Versuche auch nach Monaten noch interpretierbar.
Haltbarkeit der Lösung
- Gelöste Peptide kurzfristig bei 2–8 °C im Kühlschrank aufbewahren, aufrecht und lichtgeschützt.
- Für längere Zeiträume aliquotieren und bei −20 °C oder −80 °C einfrieren.
- Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden; jedes Aliquot nur einmal auftauen.
- Ohne Konservierungsmittel gelöste Proben möglichst rasch verbrauchen.
- Die genaue Stabilität hängt von der Sequenz ab. Methionin, Cystein und Tryptophan oxidieren leichter, Asparagin neigt zur Deamidierung.
Ein häufiger Fehler ist, die Vialangabe mit dem Netto-Peptidgehalt gleichzusetzen. Wer exakte molare Konzentrationen braucht, rechnet mit dem im Analysezertifikat angegebenen Gehalt, sofern vorhanden. Mehr unter Reinheit & Lagerung.